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话完PAR-1,再聊PAR-4,这个靶点,会被看好吗?

题记

硫酸沃拉帕沙,作为首个PAR-1拮抗剂,于2014年通过了美国FDA的批准上市,可谓揭开了凝血酶受体拮抗剂的序幕,PAR-1拮抗剂也以一种全新的姿态登上了抗凝抗栓药物的舞台。在对PAR-1及其拮抗剂进行总结的时候,发现其“兄弟”PAR-4似乎存在潜在的研究意义,故总结此文,如若对君能有些许的帮助,那便是在下极大的荣幸。


1蛋白酶激活受体PARs都有哪些成员?

蛋白酶激活受体(protease activated receptors,PARs),是细胞表面的一种G蛋白偶联受体,是G蛋白偶联受体超家族的成员之一。同其他类型的G蛋白偶联受体一样,PARs也具有单链七次跨膜的特性。作为血小板中主要的受体之一,迄今为止,PARs共有四个蛋白激酶受体被发现,分别为PAR-1,PAR-2,PAR-3和PAR-4。人类血小板表达的是PAR-1和PAR-4,鼠科动物血小板表达的则是PAR-3和PAR-4,而不表达PAR-1。


人类血小板表达的PAR-1和PAR-4两种凝血酶受体,是抗血栓药物的靶标之一。2014年5月,PAR-1小分子拮抗剂Vorapaxar (商品名Zontivity)被FDA批准可用于预防血栓形成,是目前唯一一个通过拮抗凝血酶受体活性来治疗血栓的药物(化学结构及其作用见图一)。然而,以PAR-1受体为靶标的抗血栓药物常常会导致出血事故的发生,因此Vorapaxar不能用于脑出血患者。近些年,研究发现,通过拮抗PAR-4,出血事故的风险相对较低,因此PAR-4小分子拮抗剂被认为可能成为潜在的、安全有效的抗血栓药物。

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2PAR-4的发现及其结构特征

最初,kahn和xu于1998年发现了PAR-4,他们进一步克隆了PAR-4的基因并从淋巴瘤daudi细胞中得到了它的序列,全长共4.9kb。在结构上,PAR-4的N末端和C末端的氨基酸序列不同于其他的PARs,它和PAR-2的第4个跨膜区域有34%的同源性,由385个氨基酸组成,包含一个信号肽和1个胞外N末端Arg/Gly丝氨酸蛋白酶结合位点。PAR-1、PAR-2和PAR-3都紧密连接在人类染色体5q13上,而荧光原位杂交实验显示,人的PAR-4基因位于染色体19p12上。在结合位点方面,与PAR-1和PAR-3相比,PAR-4没有促凝血酶结合的类水蛭素结合位点,对凝血酶的亲和力低于PAR-1和PAR-3,所以,为了激活PAR-4,则需要更高浓度的凝血酶。


PAR-4的激活原理同PAR-1一样:首先凝血酶与PAR-4胞外N末端结合,使N末端裂解产生新的N末端即系锁配体,这个配体与胞外第二环结合形成闭环从而激活受体并引起一系列的信号通路(见图二)。另外,人工合成的系锁配体末端的多肽片段GYPGQC (hPAR-4)或AYPGKF (mPAR-4)也能直接激活PAR-4。在PAR-3转染的COS7细胞中,PAR-3不能被凝血酶激活,也不存在PAR-3激动肽,然而当PAR-3和PAR-4同时被表达时,PAR-3被认作一个辅助因子在低浓度的凝血酶下提高了PAR-4对凝血酶的敏感度,有利于PAR-4的裂解和激活。在只有PAR-4的条件下由于PAR-4没有类水蛭素的序列,故其在低浓度的凝血酶中裂解率很低。

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3除了与血栓有关,PAR-4还可能转轨到哪些领域?

Northern blot显示,PAR-4主要分布于肺、胰腺、甲状腺、睾丸和小肠中,在消化道中适度表达。除了与血栓有关外,PAR-4还参与到其他一些重要环节,如调节血管活性、介导细胞因子、释放炎症介质和调节免疫系统等。PAR-4和G蛋白亚基间信号转导的主要偶联通路是通过G蛋白Gq来激活磷脂酶C(PLC),导致三磷酸肌醇(IP3)和二脂酰甘油(DAG)的产生从而引起细胞内Ca2+动员以及蛋白激酶C(PKC)的活化。同时,PAR-4能被多种丝氨酸蛋白酶激活,在炎症反应中起到调节水肿(通过激肽释放酶-激肽系统)和募集中性粒细胞的作用。


除了与炎症有关,PAR-4还与肿瘤相关。已有研究表明,PAR-4在肿瘤组织中的表达与正常组织相比有异常改变,并且与肿瘤恶性行为相关,例如在前列腺癌、乳腺癌、肝癌、星形胶质细胞瘤、肥大细胞白血病等多种恶性肿瘤中有高表达,而在胃癌、肺癌、食管鳞状细胞癌等肿瘤中表达却较低。在不同的恶性肿瘤中呈现截然不同的作用,说明其可能在肿瘤细胞的发生发展、侵袭转移中通过不同的途径而发挥作用。PAR-4在不同肿瘤组织中表达趋势的不一致,甚至存在相反的结果,提示PAR-4在恶性肿瘤生物学行为中的机制较为复杂, 值得更进一步的深入研究。


4PAR-4拮抗剂目前有哪些?

对于PAR-4,目前还没有相应药物上市,甚至几乎没有相关候选化合物的临床信息。相对而言,化合物YD-3是目前研究较为深入的PAR-4小分子拮抗剂(化学结构见图三)。YD-3是在2000年被发现的一个强效且具有选择性的PAR-4拮抗剂,这个吲哚唑类化合物能选择性地抑制PAR-4的激活,对PAR-4的IC50为130nM,对PAR-1的IC50为10μM。


通过研究表明,凝血酶诱导的纤维蛋白聚集不受YD-3的影响(即使在100μM浓度下),聚集时间也不受影响,这表明YD-3不影响凝血酶的蛋白水解活性。YD-3通过浓度依赖的方式抑制PAR-4激动肽GYPGKF诱导的人血小板聚集,IC50 =0.13±0.02μM,而其抑制能力可通过提高凝血酶浓度来削弱。YD-3还抑制由PAR-4激动肽GYPGKF诱导的血小板聚集,但对PAR-1激动肽SFLLRN、凝血酶、胶原和U46619诱导的血小板激活没有抑制作用。

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在2013年,Vanderbilt Univeristy的Lindsley和Hamm研究小组发现了高活性且高选择性的吲哚类化合物2.2,其对PAR-4的IC50值为66nM,对PAR-1的IC50值大于10μM。后国内有课题组从Vanderbilt Univeristy的小分子化合物库筛选出160多个与其结构类似的吲哚类似物,并通过高通量活性筛选最终发现了一个拥有新颖化学类型(chemotype)的PAR-4拮抗剂ML354,其对PAR-4的IC50值为140nM,对PAR-1的IC50值约为10μM。相对而言,化合物2.2与ML354值得进一步的深入研究。(2.2与ML354的结构式见图四)。

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小结

首先,不管怎么说,PAR-1拮抗剂硫酸沃拉帕沙的上市,为该类药物的发展迈开了坚实的一步。不过,出血风险的存在势必会对该类药物的发展起到限制的作用。药物在发现的过程中,靶点强劲 + 对应的化合物活性强,并不等于产生疗效“最佳”的药物,PAR-4相对于PAR-1也许正如此。倘若说,靶点适度的PAR-4已经确定,那么,相关拮抗剂的开发及其疗效的进一步探索,是否应该加快脚步呢!


参考文献:

1. Wan D, Summer E, Matthew T, et al.Substituted indoles as selective protease activated receptor 4 (PAR-4)antagonists: Discovery and SAR of ML354[J]. Bioorganic & MedicinalChemistry Letters, 2014, 24(19): 4708-4713.

2. French S, Arthur J, Tran H, et al. Approval of the firstprotease-activated receptor antagonist: Rationale,development, significance,and considerations of a novelanti-platelet agent[J]. Blood Reviews, 2015, 29(3):179-189

3. 温万东. PAR-4拮抗剂、GIRK1/2激活剂和MrgX1正向别构调节剂的设计、合成与活性评价[J]. 西北农林科技大学, 2014.

4. 吴凌燕, 叶景佳, 曹江.蛋白酶活化受体4在肿瘤中的作用[J]. 中国细胞生物学学报, 2016(2): 216-224. 

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